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有機化学を中心に、興味ある新着論文の情報を提供してゆきます。

カテゴリ:生化学

Pingping Hou*, Yanqin Li*, Xu Zhang*, Chun Liu*, Jingyang Guan*, Honggang Li*, Ting Zhao, Junqing Ye, Weifeng Yang, Kang Liu, Jian Ge, Jun Xu, Qiang Zhang, Yang Zhao, Hongkui Deng

 ☆化合物だけで作るiPS細胞
 2006年、京都大学の山中伸弥らが発表したiPS細胞(人工多能性幹細胞)は、世界に大きな衝撃を与えました。通常の細胞にわずか4つの遺伝子(oct4, Sox2, Klf-4, c-Myc, 合わせて山中因子と呼ばれる)を導入するだけで、人工的に分化万能性を持たせることができるというものです。すでに、医療をはじめとする多くの分野に強いインパクトを与えており、山中教授がこの功績で2012年のノーベル生理学・医学賞を受賞したことは記憶に新しいところです。

  この発表直後から議論されてきたのが、「低分子化合物によるiPS細胞作成は可能か」という点です。遺伝子導入という、他分野の研究者からすれば「特殊な」技術を用いずに、いくつかの低分子化合物をふりかけるだけでiPS細胞が作成できるなら、これは革命的なことです。

 すでに人類は、タンパク質の持つ様々な機能を代替できる低分子化合物を、いくつも見出しています。その最も身近な例は、いくつかの医薬品です。となれば、4つの遺伝子の機能を代替する低分子化合物を見出す可能性は、ゼロではないと考えられます。とはいえ、ひとつのタンパク質の機能を置き換える低分子化合物さえ、見つけ出すのは相当に困難ですから、山中因子全てを置換するのは至難の業と考えられてきました。

  今までにもこうした努力は行われており、山中因子のうちのいくつかを、低分子化合物で代替した例は出てきていました。しかし今回、北京大学などのグループによって、「化合物のみによるiPS細胞の作製」という衝撃的な報告がなされました。

 この論文を一枚で表現した図がこちらです。
青六角形で示された4遺伝子(O:oct4 S:Sox2 K:Klf-4 M:c-Myc)が、順番に低分子化合物に置き換えられていく様子を示しています。すでに、Y. Li et al., Cell Res., 21, 196–204 (2011)において、山中因子のうちSox2,Klf-4,c-Mycは、赤長方形で示された4つの低分子化合物(VPA,CHIR,616452,Trabyl)で代替できると報告されていました。
CiPS1
Fig. S30 を改変(番号を追加)   

 そこで、残っているOct4の代替になる化合物を見つけることをまず始めに行なっています。ここで、ライブラリーの10,000種の化合物から、FSK, D4476, 2-Me-5HT等の代替候補を見つけてきています。その中で効率よく代替していたFSKを使っています。しかし、FSKはOct4プロモーターを活性化させていますが、プロモーター配列がメチル化しているため、Oct4が発現が抑制されていました。プロモーターの脱メチル化のために、DZNepをスクリーニングから見つけて来ました。こうしてFSK+DZNepでOct4の代替が可能になりました。

 カギを握る4化合物の構造は下記の通り。CHIR99021はグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK-3β)阻害、フォルスコリンはcAMPの産生促進、616452はALK5阻害、3-デアザネプラノシンAはヒストンメチル化酵素阻害などの作用を持ちます。

4comp

 4遺伝子の代替化合物が見つかったので、FSK, VPA, CHIR, 616452, Trabyl, DZNepを細胞に暴露しました。暴露することによってOct4は発現するようになりましたが、Nanogをはじめとする万能性マーカーの発現が依然抑えられていました。そこで、2i-mediumというiPS細胞作成時に使われるキナーゼ阻害剤入りの培地を使うことで、この問題を解決することに出来ました。出来た細胞は、iPS・ES細胞と同じような発現プロファイルを持っていました。

 彼らは作成した細胞(CiPSCs: Chemically induced Pluripotent Stem Cells)を、マウスの受精卵に入れて、キメラマウスを作成しました。キメラマウスは、CiPSC由来の細胞からできた消化器や神経を持っており、CiPSCが分化万能性を持つことを証明しています。また、キメラマウスの180日生存率もiPS細胞キメラマウスと比べても高く(100% !!)、より安全なiPSといえるかもしれません。

 また、化合物の最小化と最適化を行なっています。FSK, VPA, CHIR, 616452, Trabyl, DZNepの6化合物から1化合物ずつ抜いてみたところ、VPA, Tranbylはなくても効率が下がるだけでしたが、FSK, CHIR, 616452, DZNepの4化合物は抜くと万能性マーカーを発現しませんでした。そこで、FSK, CHIR, 616452, DZNepの4化合物のみでやってみると、効率は10分の1以下にがってしまうものの、iPS細胞の作製自体は可能でした。

 最適化では、スクリーニングを行なって、TTNPBを見つけてきています。TTNPBを加える事によって、10倍以上高い0.2%という作成効率に至っています。
TTNPB
TTNPB (レチノイン酸アナログ)

 また、FSK, CHIR, 616452, DZNepがどの遺伝子に対して活性化/不活性化を行なっているのかを調べています。これの解析だけでもかなりの量があるので、興味がある方は読んでみてください。

 感想として、実験量の多さがなんといっても凄いです。Supplementが54ページ,Figureが30個とSupplementを読むだけでもかなりの読み応えがあります。特に、FSK+DZNepという組み合わせを見つけてくるための実験系には工夫が凝らされており、レベルの高さを思い知らされました。実験量の多さを表しているのが、Co-1stが6人、Co-2ndが7人、コレスポが2人という著者陣ではないでしょうか?

 エピジェネティックスを弄る化合物をふんだんに使っていて危険そうなのですが、キメラマウスの生存率が高いので、思ってるよりも安全な作成方法なのかもしれません。もちろん、より安全性を調べないといけないですし、なによりヒトでも同じようにいくかという疑問もあります。しかし、こういう結果をみると、低分子化合物の力の偉大さを感じざるえません。

Chun-Jun Guo, Hsu-Hua Yeh, Yi-Ming Chiang, James F. Sanchez, Shu-Ling Chang, Kenneth S. Bruno, and Clay C. C. Wang
J. Am. Chem. Soc. ASAP DOI:dx.doi.org/10.1021/ja3123653

 ☆遺伝子を壊して生合成経路を調べる
 糸状菌(カビ)の一種であるAspergillus terreusより単離された化合物Acetylaranotinの生合成が明らかとなったという論文。Acetylaranotinの構造的特徴は、ジスルフィド結合を有するジケトピペラジン骨格(Epipolythiodioxopiperazines)です。このジスルフィド結合は、毒性に関与しているとされており、薬への応用、全合成(Reismanら徳山ら)など多方面からの注目を集めています。

Clipboard01


 ポストゲノムの時代に入り、ネット上に公開されているゲノム情報を基に生合成遺伝子、二次代謝酵素を探索する「ゲノムマイニング」という手法が流行り始めました。現在では、ある微生物のゲノム情報が公開されると同時に、激しい生合成研究の競争が始まります。 このような状況で、生合成研究のスピードは近年爆発的に速くなっています。

 今回の論文で、筆者らはゲノム情報を基に遺伝子破壊実験を繰り返し、生合成遺伝子を特定しました。注目すべきなのは、今回の論文のみではなくClay Wangの一連の仕事です。彼は、公開されている糸状菌のゲノム情報を基に尋常ではない早さで糸状菌二次代謝物の生合成経路を次々に明らかにしています。糸状菌を研究している研究者は、今後もClay Wangに要注目です。

Yoshiki Tanaka, Christopher J. Hipolito, Andrés D. Maturana, Koichi Ito, Teruo Kuroda, Takashi Higuchi, Takayuki Katoh, Hideaki E. Kato, Motoyuki Hattori, Kaoru Kumazaki, Tomoya Tsukazaki, Ryuichiro Ishitani, Hiroaki Suga & Osamu Nureki
Nature (2013) doi:10.1038/nature12014

 ☆病原菌が医薬分子を吐き出す仕組み
 先日は藤田誠先生の結晶スポンジの発表で化学クラスタが沸き返りましたが、その論文と同じ号のNatureに掲載されたもの。東大理学部の濡木理教授・菅裕明教授の共同研究によるもので、こちらも非常にインパクトのある論文です。

 病原菌に対して抗生物質を投与していくと、菌に耐性が生じて効き目がなくなってくることはご存知かと思います。原因はいろいろですが、ひとつには膜タンパク質輸送体というものが、菌の細胞内に入り込んだ薬剤を外に放り出してしまうというメカニズムがあります。今回、この膜タンパク質輸送体「MATE」の詳細な構造がX線結晶解析によって明らかにされ、機能も解明されたというものです。

MATE
膜タンパク質輸送体MATE
 
 ご覧の通り、α-ヘリックスが束になったものが、V字につながっており、これ自体が膜に埋まっています。このV字の谷間に薬剤分子が捕まり、ヘリックスの一つが折れ曲がることでこれを細胞外へ吐き出すという仕組みです。  さらに、この論文ではMATEの阻害剤を創出し、それがどう結合しているかも分析しています。上の図で、谷間に挟まっている分子がそれで、環状のペプチド構造です。阻害剤だけの構造を下に示します。

cycpep
阻害剤の環状ペプチド
 
 こんなに簡単に阻害剤が見つかるのかと思いますが、それを実現したのが菅教授の「RaPID」と呼ばれる技術です。遺伝子の暗号を書き換えることで、多様な環状ペプチドを自在に創り出すというものです。詳細は、以前にインタビューした際のこちらの記事をご覧下さい。

 というわけで、この研究は多剤耐性菌の薬剤排出のメカニズムを明らかにしたばかりか、それを防ぐ医薬開発の足がかりをも提供したわけで、特に製薬企業などにおいては興味がもたれるものではと思います。

Joshua Levitz, Carlos Pantoja, Benjamin Gaub, Harald Janovjak, Andreas Reiner, Adam Hoagland, David Schoppik, Brian Kane, Philipp Stawski, Alexander F Schier, Dirk Trauner & Ehud Y Isacoff

Nature Neuroscience  03 March 2013 (AOP) 
doi:10.1038/nn.3346


背景:Gタンパク質共役受容体とは
2012年のノーベル化学賞がGタンパク質共役型受容体の研究に与えられたことは皆様の記憶に新しいかと思われます。
シグナル分子がGPCRに結合すると細胞内にシグナルが入ります。細胞膜に存在する受容体は薬剤の標的になることから盛んに研究が進められており、これ迄様々なGPCRの発現パターンと機能が明らかにされてきました。


背景:神経細胞のGタンパク質共役受容体
神経細胞には2種類のグルタミン酸受容体、イオンチャネル型グルタミン酸受容体Gタンパク質共役型グルタミン酸受容体が存在します。Gタンパク質共役型グルタミン酸受容体(mGluR)には8つのファミリータンパク質が存在しますが、これらの内在性リガンドは何れもグルタミン酸です。
 これまでに各mGluR選択的リガンドが幾つか発見されていますが、mGluRは細胞全体に広く存在し、またmGluRは前シナプス細胞と後シナプス細胞にそれぞれ存在することから、受容体の機能を時空間的に解析することが難しいのが問題とされてきました。



Synthetic photoswitchable thetered ligandの開発
今回の論文で筆者らはMaleimideに光異性化できるAzobenzeneを付加し、さらにグルタミン酸を繋いだリガンドを開発しました。D-MAG (D-maleimide azobenzene glutamate) と名付けられたこの化合物は380nmの光を当てるとcis状態になり、500nmの光を当てることでtrans状態へと可逆的に変化させることが出来ますmGluRのタンパク質結晶構造解析の知見から、筆者らはリガンド結合部に当たる300番目のLeucineをCysteinに置換してそこにD-MAGを付加することで、光のON-OFFで受容体とリガンドの結合を迅速に制御可能であることを見出しました。

D-MAG
Gタンパク質受容体の活性を光で可逆的に制御出来た
  mGluRにDMAGを付加したlight-antagonized mGluRs (LimGluRs) を培養神経細胞に発現させ、380nmと500nmの光を当てることで神経細胞の電気的な応答を可逆的に変化させることを達成しました。また他のサブタイプであるmGluR3, mGluR6も同様の手法が適用出来ることを明らかにしました。さらにこの手法をゼブラフィッシュに応用することで、個体レベルでも受容体の活性を光制御可能であることを示しました。
 

光で受容体-リガンドの結合を制御する手法の利点
これまで内在性リガンド(グルタミン酸)に結合しないように変異を入れたmGluRを発現させた実験が行われ、シナプス前細胞とシナプス後細胞における機能の切り分けは可能でした。しかし薬剤は細胞全体に分布した受容体を広く活性化させるため、受容体の時空間的機能は分かりませんでした。
 光を利用した今回の手法は、受容体とリガンドの結合を時空間的に制御出来ることに大きな利点があります。タンパク質の構造とリガンドの大きさによっては他のGPCRに応用することも可能かもしれません。
 今回作成した変異型受容体は内在性リガンドとの結合能も有しているため、内在性の受容体と置き換えた変異動物を作れば、GPCRが個体に与える影響を調べることを可能にします。どのようにしてD-MAGを個体に投与するか?個体で効果的に光刺激する手法は?などと問題は残りますが、今後の研究によって解決されることを期待します。

Gražvydas Lukinavičius, Keitaro Umezawa, Nicolas Olivier, Alf Honigmann, Guoying Yang, Tilman Plass, Veronika Mueller, Luc Reymond, Ivan R. Corrêa Jr, Zhen-Ge Luo, Carsten Schultz, Edward A. Lemke, Paul Heppenstall, Christian Eggeling, Suliana Manley & Kai Johnsson
Nature Chemistry (2013) doi:10.1038/nchem.1546 

背景
 目的とするタンパク質の生細胞における挙動を観察するために様々な蛍光プローブが開発されています。生細胞イメージングに最もよく用いられている蛍光プローブは、GFPを始めとする蛍光タンパク質です。しかしタンパク質の分子サイズが大きいことや蛍光を発するまでに時間がかかると言ったデメリットもあり、これらの欠点を解決する蛍光色素の開発が求められています。
 赤外の波長は光毒性や自家蛍光と言った問題を受けにくいことから、明るくて褪色も少ない赤外蛍光色素が開発されてきました。しかしこれらの色素を細胞に投与すると、細胞膜に対する透過性が低かったり細胞内で非特異的吸着を起こしてしまい、それらの問題を解決するために煩雑な実験操作が必要でした。
 これらの問題を背景に、筆者らは『明るく、非特異的吸着が少なく、膜透過性が有る赤外蛍光色素の開発に取り組みました。


結果
1.Silicon-rhodamine色素は膜透過性が高くS/N比が高い赤色蛍光色素である
 今回の論文で 筆者らは650nm付近に吸収極大波長を持つsilicon-rhodamine色素(SiR色素)を新規に合成しました。既に良く使用されているSNAPタグやHaloタグにこのSiR色素を融合させて細胞に投与すると30~60分で細胞内に取り込まれました。またSiR色素を用いて核・ミトコンドリア・細胞骨格に局在するタンパク質の分子局在をクリアに観察することが出来ました。

SiR
SiR色素

2.SiR色素を用いた超解像イメージング
 近年になって光学分解能を越えた顕微鏡技術を用いた生細胞イメージングが行われています。筆者らはSTEDとSTORMという超解像顕微鏡にSiRが使用出来ることを確認しました。

3. 非自然アミノ酸をSiR-tetrazineでラベル出来る
 目的タンパク質に非自然アミノ酸を導入する手法は、20-30kDa程度の分子量を持つペプチドタグによるアーティファクトを減少させ、またタンパク質を位置特異的にラベル出来るとされます。筆者らはtrans-cyclooctene lysineという非自然アミノ酸を導入したタンパク質を発現する大腸菌にSiR-tetrazineを投与することで蛍光ラベルすることに成功しました。
Crick
SiR導入。金属触媒フリーのクリック反応。

展望
今回の論文で生細胞イメージングに適した赤外色素が開発されました。筆者らはこの色素を用いて組織染色も行なっており、SiR色素は細胞レベルで分子局在を観察するのみならず、組織・個体レベルで観察を行うためにも有用なツールになるかもしれません。

Xin X. Zhou, Hokyung K. Chung, Amy J. Lam, Michael Z. Lin
Science 338, 810 (2012) DOI: 10.1126/science.1226854

 ☆光でタンパク質の活性を制御する
 人為的にタンパク質の活性を制御することは、細胞においてタンパク質が果たす生理的な役割を調べるために有効な手段となります。近年になって目的タンパク質に光感受性のタンパク質を融合させることで、光照射のON・OFFでタンパク質機能を制御する方法が開発されています。

 Dronpaは理化学研究所のグループがサンゴの一種から発見したタンパク質を改変することで作成した蛍光タンパク質です。Dronpaは紫外光を当てると光を発するようになり、青色光を当てると消光する特性を持ちます。またこの明状態・暗状態の遷移は可逆的に何度も起こすことができます。

 今回の論文で筆者らはDronpaの145番目のリジンがアスパラギン酸に変異したタンパク質に着目しました。このDronpa145Nは明状態では四量体を形成し、暗状態で乖離して単量体になります。
dronpa
Dronpa四量体

 筆者らはDronpa145K-Dronpa145Nをタンデムにつなげたプローブを作成することで光依存的なタンパク質の活性制御を達成しました。暗状態では目的タンパク質の活性部位が2つのDronpaによって隠されますが、明状態にするとDronpaが乖離して活性部位が露出します。

 本研究ではアクチン細胞骨格の動態を制御するcdc42とタンパク質分解酵素であるHCV NS3-4AプロテアーゼにDronpaタンデム二量体をそれぞれ融合させ、光依存的にこれらのタンパク質機能を制御することに成功しました。光のスイッチで、酵素の活性をオン-オフ切り替えできるようになったわけです。

 これまでの光感受性タンパク質を用いた手法では上手く機能する光制御型タンパク質をスクリーニングすることが難しかったが、今回のDronpa変異プローブを用いることで効率的に光制御型タンパク質を作成することができると筆者らは述べています。光によって人為的にタンパク質機能を時空間的に制御することで、これまで不明であった細胞内における生理的機能を解明することが期待されます。

Toshiaki Mori, Atsushi Hirose, Tatsuya Hagiwara, Masanori Ohtsuka, Yoshimitsu Kakuta, Koji Kimata, and Yoshio Okahata

J. Am. Chem. Soc., Article ASAP DOI: 10.1021/ja309646s

☆ヒアルロン酸合成を可視化

ヒアルロン酸といえば保湿成分を思い浮かべるでしょうか。現在では様々な製品に配合されています。ヒアルロン酸は元々生体中に存在する多糖であり、多様な生理活性を持ちます。ただし、多糖を多糖のまま検出することは簡単ではありません。今回の論文ではヒアルロン酸合成を原子間力顕微鏡で検出、可視化し酵素反応の動態を算出することに成功しています。
2012 JACS HA
ヒアルロン酸が伸長されていく様が一目瞭然!直感的に理解できます。伸長速度は、雲母に酵素を固定化した場合1.8残基/秒、脂質二重層に固定化した場合は平均2-4残基/秒だったそうです。

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