地平線の彼方で

Biochemist & Structural Biologist
治療中
興味のあること: Proteinase, protein engineering
ちなみに地表からみえる地平線は所詮4000mほど先で,滑走路並みに近かったりする...(C) 2007-2019

移植

先日,腎臓移植を受けました.

もうかれこれ4年前にエモリーのERに運ばれてから,透析生活をしていました.

ようやく移植の順番がまわり,移植することができました.

まずは療養に集中ということです.

NARとStructureにアクセプト

1つはEmoryでの最後の仕事,ってか,2013年の9月から11月までやっていた仕事がNARに(プロジェクトが始められてから6年近くなるもので,ほとんど関わっていない...).もう1つはBromodomainの仕事でStructureに

Structureの方はようやく正式なアクセプトになったので,まだon-lineにはなっていないけれども,BioRxivで読める.マイナーリビジョンなのでほとんど変わっていないけれども,ばっさりいかせてもらったところもある.




いろいろあると思うのですが,こっちもいろいろ思う部分があって.
誰かに消してと言われたからではなく,定期的なものなのでそれ以上でもそれ以下でもなくなので..メールとかでもいいのだけれども,電話の方がいい.




仕事の仕方や,物事の見方はそれぞれなのですが,結局は何かを読んでとかというのは完璧性が欠如してしまうので,時間をかけてでも自分の力で切り開いていかなければどうにもならないと思ったりもします.


HEPES 6.0とHEPES 8.5から立ち直れていないけれども,そういうところを見逃したのは,僕自身が未熟だったとしか言えないし...


HEPES 6.0とかってBufferもどきを作ること自体基本が出来ていないわけで,基本ができていないとどうにもならない.一方で,自分自身の固定観念で重大な見落としが出てしまったのは大失態...accepted in principleとなってから気が付いても遅すぎる...

さらに,他にもあった.このようなリスクが高すぎる仕事はもうやらない...







学生さんには,タンパク質を精製して結晶を作って,結晶を拾ってもらったり,X線回折実験を一緒にやったり,学生さん本人で構造を決めていくというこういう実体験を経ながら学んでいくことが必要で,もちろん最初はシニアな人による強力なガイドは必要だけれども,徐々に本人にやってもらって,経験した上で学んでいくことが重要.

本を読んた.というのとは全く異なる次元のエキサイティングな体験をすることが重要で,多少じれったい部分があっても,1週間と2週間の違いみたいなものでほとんど誤差みたいなものだし,PIが待てないから,全てやってしまうというのではなく,積み重ねなので.論文書きでも1つ書いて,2つ書いて,その積み重ね.自分の経験から学んでいけばいいことだし...



株でもFXでもそう.

結局本を読んだだけでは勝てないし,かといって高いお金を払ってセミナーに行っても勝てない
自分で成功体験,失敗体験をしてそこから学ぶ以外に他ならない.
ちょっと株価が下がってあたふたしたり,底値で売ってとか...
自己資金で,やり直しのきかない本番を経験しないと精神が鍛えられないし,全てを獲得しようとして,底で売りを入れたり,底で損切りしてしまう.

デモ口座で遊んでもほとんど意味がない.


精神が鍛えられていないまま,退職金の2000万円をそのまま銀行員の言われるまま投資をして,損失をするようなことはして欲しくないわけで.


そういう部分で意図を理解してくだされば...



若い時に少しずつ投資して,失敗したり,儲かったりってプロセスは無駄のように見えても必要なものだと思います.

株が下がってきたから,今が底!!とおもって買いを入れる前に,もう少し我慢して,上昇してきてからでも遅くない.でないと,ここが底と思っていても,さらに底抜けして含み損を抱えてしまう.そして含み損に耐えきれなく損切りをした瞬間に株価が上昇する.


全てにおいて利益を取ろうとするとそうなるし,3回に1回でも確実に利益を取れるならば,2回分とりこぼしても,そっちのほうが結局利益が出る.欲が出たらだめだし,損失が出たから取り戻そうという意識が高くなってしまうと...

それにリスクのある仕事に全財産をかけたらダメだということではないだろうか?
こういうのは外から見れば,仕事をしていない奴だということになるのでしょう...

グリーンカード 雇用ベースの面接

今年(2017年)の秋頃から,雇用ベースのグリーンカードの申請に面接が必須となっている.
ネットで検索しても,婚姻ベースの面接で何を聞かれたか?はあっても,雇用ベースのものの面接体験談はなかったので,色々心配になったわけでした.もう面接はほんと嫌です...


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グリーンカードの重要性


USでの滞在はヴィザに厳密に制限されていて,グリーンカードを持っていない限り,そのヴィザは仕事に結びついているので,仕事を失うことは,非移民ヴィザ(H, J, Fなど)の要件を満たさなくなり,即刻退去になる.



USに滞在したい人は,仕事に不満があっても簡単に辞めることはできず,ヴィザステイタスを人質に取られていることになる.なので,USに長く滞在するかも?って人は早めにグリーンカードを取得したほうがいい.(弁護士費用やファイルにかかる費用などで$10K程度かかるので,その分も考慮する必要がある.)常にハッピーでいられるわけではない...


どれぐらいの期間で審査の結果が下りるのか?
日本出生者(日本国籍者に限らない)は比較的順番なしで審査が回ってくる.
ただEB-3であったりすればプライオリティーデートが来るまでファイルできないので,待つという作業が必要になる.ファイルした後もとにかく待つ.次の予定を立てたくても...ということになるので,お金と時間に余裕がある間にファイルするのがいい.


特にUSの外に出る必要がある時.
これは弁護士さんに相談するといい.有効なH visaをもっていれば,問題はないようだけれども...
とにかく相談すれば教えてもらえる.




調べた限りですが(),Jでは30日のグレースピリオド,Hにはグレースピリオドは存在しないけれども概ね1ヶ月というのがあるらしい(おそらくHRが当局に報告するのが1ヶ月後?).注意しなければならないのは,1日でもグレースピリオドを過ぎたり,out-of-statusになったらそこから不法滞在が始まるので,USに入国することが非常に難しくなる.ESTAは不許可になる.USを通過するだけでもヴィザが必要になる...
また,グレースピリオドの間に海外旅行をしてUSに再度入国するというのは認められていない.
その期間はUSから立ち去るための準備期間のため.



ESTAはUS国内で他のビザに切り替えることができない.
ESTAの目的にあっていない人は,適切なvisaを取得することが求められる.

ビジネスなのに観光というのも,虚偽になるので.”USではとにかく嘘をついたらダメ”.
ESTAはビジネス,観光に使える.(もちろんUSでW-2が発生する仕事(バイトも含む)はESTAでは不法労働になる)






なので,ESTAで入国→F1などのヴィザによる滞在の資格にUS国内で変更することは出来ない.一旦国外(メキシコ,カナダを含めない)に出国してあらたに入国審査を受け,I-94を発行してもらう必要がある.






ヴィザは入国審査を受ける資格で,ヴィザの有効期限が切れていても滞在資格I-94が有効な限り,合法的に滞在できる.「I-94に記載されている期限」が絶対で,飛行機が飛ばなかったから出国できなかったというのは理由にならないらしい.

逆に,Visaの有効期限があっても,絶対にI-94の期日は守らなければ,不法滞在歴が始まる(D/Sはduring statusなので,D/Sとあればステータスを維持している間は滞在が許可されているということになる)

I-94の更新が必要ならば,国外(メキシコ,カナダ以外)に出国して,入国時に審査を受けて,新たなI-94をもらう必要がある.そのままvisaの有効期限とI-94の有効期限は一致していないこともあるようなので注意.

メキシコ,カナダへの出国はUSからの出国とは認められないので,新しいI-94が必要な時は,それ以外の国へ出国することが必要になる.

病気,事故による入院などはなんとかなるらしい.D/Sと記載されていれば,合法滞在の為にはそのステイタスを維持をしていなければならず,そのステイタスが終了した時点で滞在資格が無効になる.その時のグレースピリオドの取り扱いは所属のHRもしくはInternational Officeに聞くのがベスト.



家族ヴィザは,メインのヴィザが失効すれば同時に失効するので,奥さんと子供はUSに残って...というのは出来ない.子供の卒業式が間近に迫っていても3月31日で帰国だと,卒業式を眼の前にして帰国しなければならなくなる.


また,AOS (I-485)をファイルすると,ペンディング状態になるので,I-94の有効期限が切れても,滞在は合法である.ただし労働は有効なJ or H visaもしくはEAD(労働許可証)がなければ不法労働になる.
ちゃんとしているところではHRに確認すれば全部教えてくれる.

Jは移民の意思を示してはいけないvisaなので,Green Cardをファイルしている時にJ visaを更新することはできないらしい.ので,気をつけるのが一番.弁護士さんに事前に相談することが必要.

ファイルしてAPが届いていないうちに日本で学会で〜とかなるときもある可能性があれば,前もって相談するのがいい.
特に,Jや,Fなどの移民を意思を示してはいけないヴィザは,大使館での面接時,さらに入国審査官に期間が終わったら帰国しますという意思を明確に示さなければならない.気が変わることもあるわけで,それは6ヶ月後ぐらい?から?

グリーンカードをファイルするというのは移民の意思そのものなので,Jからgreen cardは少し気をつけないといけない.弁護士さんに事前に相談することが必要.


労働を通じたグリンカードEB-1, -2, -3はファイルした組織で労働していることが原則になるので,プータローというのはダメになる.グリンカードのファイルに伴うEADを用いた労働は,現在の仕事と同等であることを前提としているので,CVSとかでバイトという為には使わないでほしいとのこと.会社,組織を通じたEB-1,2,3は,グリーンカードを取得してから6ヶ月は転職はしないでほしいと弁護士さんが言っていた.NIWは個人スポンサーなので,転職は許可後すぐにでも可能になる.

このあたりは弁護士さんに聞けば最新のものを教えてくれる.




H-1bのヴィザはnon-profitであれば無制限に発行されるけれどもprofitで働くとなると発行数に上限があり,上限を超えると抽選ということになっている.また10月1日から働けるH-1bの応募は4月の1週目で締め切られる.なので,企業で働くには外国人にとってはグリーンカードが絶対必須になる.
企業に応募すると,HRのあるところはヴィザサポートが必要か?というチェックが存在する.おそらくヴィザサポートが必要な人は元から雇わないというのがデフォルトになっている.

H-1bヴィザは企業・組織がファイルするものなので,個人でファイルするものではない.CVなどを準備する必要はあるけれども.なので,H-1bヴィザは企業・組織が採用すると決まらないと何も進まない.

またnon-profitのH-1bからprofitのH-1bへはtransfer出来ない.逆は可




なのでアメリカで働く上の一番大切なものは,英語力ではなく,労働ヴィザになる.
これがなければ,何も始まらないし,英語が話せても,ヴィザがなければ働けない.
さらにその労働ヴィザは,採用する企業によってファイルされるために,個人ではファイルできないので注意.


永住権を得る一番簡単なのは米国市民との結婚だったりする.
今は永住者との結婚でも1年ちょっとらしい.






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USに住んでおられれば,当然のことと思いますが,面接官に裁量があるので,質問内容が変わったりするわけで,あくまで参考として.
書類を持っていかなくてダメでしたとかいうのは僕の免責になるので.
そして移民法はコロコロ変わるので,2017年秋現在の情報です.



ファイルしたのはEB2-NIWです.I-140をファイルしたのが2016年の12月22日ごろ.I-140がアプルーブされたのが,2017年の6月ごろ,


移民弁護士は口コミで選んだ(なおみと同じ人).ちなみに移民弁護士は地域の弁護士さんである必要性は全くない.なので,僕の移民弁護士はGAの人.もともとフィリーに移る予定はなかった.
CVとGoogle Scholarのページ(当時のcitationは1000ぐらいだった気がする)を3人の弁護士さんに送って,コンサルタントを受けて,費用,掛かる時間を問い合わせた.
EB1だと費用が掛かるかつ時間もあまり短縮されないということだったので,EB2-NIWでファイルすることにした.弁護士費用は,当時の価格で$4500で,I-140をファイルした時と,I-485をファイルした時の2回の分割払い($2,250 each)

一度電話で相談した.もちろん電話が苦手ならば直接面談というのもアリ.
その1回の電話以外は実は1回も会ったこともなく,全てメールでのやりとり.


準備に時間がかかったのはReferenceで,6人に頼んだ.
当時のラボのボス(本人が書いた)
共同研究者のDepartment Chair / NASのスティーブ(自分が書いた)
共同研究者の元Department Chair / HHMI professorのヴィクター(本人が書いた)
大学院の時の指導教官のSさん(自分が書いた).
学部からの友人Kさん(自分が書いた)
GSKの友達のウエンディー (本人が書いた)

話題が被らないように(色々やっていたので,そんなに難しくなかった)

毎週会っているとある人はなかなか書いてくれなかったので(いつものこと),意外と時間がかかってしまった.



全ての推薦状が揃って,弁護士さんに添削をしてもらって,リバイズ後にサインをもらって弁護士さんに送信.

あと集めたのはプレスリリース

それらを弁護士さんに送信した後,1ヶ月程度で弁護士さんにまとめ記事を書いてもらってファイル.
エピジェネティックスとはなんぞやというのをNIHのページから引用したり,推薦状から引用して,いかにアメリカに重要な貢献をしているのかということをまとめてくださった.これは弁護士さんの仕事なので,ほとんどは弁護士さんの指示に従って書類を用意した.

またほとんどの書類はフォトコピーで十分なので(現物は必要ない),必要なものは日本からスキャナーでemailで送ってもらった.






指定医師による健康診断書が必要で,僕は重病になっているけれども
感染症に関係して健康であることが求められるようです.
予防接種を受けているか,性病やHIVなどの感染症になっていないか.

診断書は有効期限があるので,I-485をファイルする直前に書いてもらった.
TBの検査や,抗体値を測定してからとかになるので,2週間ほどかかると見た方がいいかもしれない.
だいたい1人500ドルぐらい...何十年前の母子手帳ってね...結局は古いからもう一回測定するというのがデフォだと思われる.

ワクチン反対派はUSに住むことは厳しくなる.
子供の学校でもワクチン接種歴が求められる.




ちなみにMedicareを受けていても,これはpublic serviceにはならないらしい.
(Medicaidは貧困層のための保険.Medicareは高齢者・一部の障害者のための保険)







I-485(AOS)をファイルしたのが7月21日ごろでテキサスに送られる.Finger printは8月中旬(日付,日時は指定され,2週間ほど前に案内状が送られてきた.場所は居住地によるものと思われる.)

ローカルオフィス(フィリー)にトランスファーされたのが9月中旬
EADとAPがアプルーブされたのが11月初め.現物が送られて来たのは10日前後後.
グリーンカードに伴うEADを使用するときは弁護士さんと相談してからの方がいいと思う.


面接はサンクスが終わった時.

面接は1:15分からとなっており,セキュリティーを通過して2Fでチェックインを済ませて待っている.フィラデルフィアのマーケット41th streetのところでは携帯持ち込み可でした.(ダメなところもあるらしい)


名前を呼ばれて,オフィスに.


まず,右手をあげて宣誓
ID(パスポート)と面接の日時の書いてある紙をわたす.

顔写真をとって,左手と右手の人差し指の指紋を取る

提出した書類は,出生証明(ノータライズした翻訳付きの現物とコピー),雇用先からのレター(コピー),給与明細(3ヶ月分),I-94, 過去のパスポート(JとHのヴィザスタンプ付き),H-1b関連の書類の束

3年分のW-2、TaxReturnの書類などは持って行ったけれども要求はされなかった。

最初に聞かれたのは,名前,DOBで
母親,父親の名前をスペルアウト.
ちなみに,両親の誕生日は聞かれなかった.
あと、携帯の電話番号の確認

持ち物チェックリストにI-864が...と書いてあったけれども,これは必要がない.
3年分のTax returnも持って来たけれども,それも必要なかった.
ラブラブ写真もいらなかった.


聞かれたことはUSの滞在歴.
J1でいつ入国して,H-1bに変更して,...そこに怪しい空間がないかチェックしていた.
2013年12月に入国した時のI-94の番号だったので,それ以降,I-94の番号に変更がないか?と言う確認.現物を見せる.現物はH-1bに付いてくる切れ端をみせた.コピーを取っていたので,そのコピーを持っていかれた.




どこで働いているのか?なんの職業をしているのか?雇用先のレターと給料明細でチェック.


なにか社会的なグループに入っているか?ということ.
学会に参加している(お金を寄付している)ので,それを.
最初聞かれたときは,?って感じで,入っていないと言ったけれども,学会のことを書いていたので,あ,そうそう!って答えた.




あと,テロリストですか?とかI-485にある質問を再度聞かれる.
2-yr ruleにというのがあるので,そこがある人はYesと言わないといけない.僕はno
目の前でチェックしながらなので,No.と言う.ちゃんと質問が終わってから.






問題がないので,しばらくしたら現物が送られてくると伝えられて終了.


意外と長かった...終わったのが1:50なので,30分ぐらい?色々提出されたものと,今回持って来たものが同じかチェックしていくとこれぐらいだろう.実は何時に呼ばれたか気にしていなかったのだけど,20ー30分ぐらいじゃないかなぁ?
面接官の人もなれていなかったので,段取りに多少手間取っていた部分もあったので.

次は現物が届くのを待つと言うところになる.




この面接の後にI-485が正式にアプルーブされたのが10日後の12/8(Fri)で、アプルーバルレターが来たのが12/14(Thr)になる。その間、websiteは"Interview is scheduled"のまま変わらないまま放置されていた。
現物のカードが届いたのが12/18(Mon)でした。そして最後までInterview is scheduledのままでした。

I-140をファイルしてほぼ1年ということでした。トランプ政権になっていろいろな変更があったけれども、時間的には弁護士さんの予想通りの1年でした。

Approved

何気にEAD & APが、先週土曜日に?Approvedされていた。

ということで、今週もしくは来週中にEAD & APが届くことになる。
これは一つ前進。今年の10月から雇用ベースでも必須となったグリーンカードの面接がサンクスが終わった直後にあるので、EADがあることで、グリーンカードが届く前の12月4日からVisaなしで新たな職場で働けることになる。12月1日としないのは健康保険のため。



これまで面接は婚姻ベースのみ要求されていて、雇用ベースでは逮捕歴など問題のある人のみが面接を受けなければならなかったらしいのだけれども、雇用ベースの人も10月から面接が義務付けられたらしい。弁護士さんに聞くと、付き添いが必要なら$1000と旅費ということで、丁寧に断った。



ちなみに弁護士費用,ファイルの費用が少し安いということと、日本人はEB1/EB2であまり時間的な差がないということでEB2-NIWでファイル。


今のところのタイムラインは

I-140をファイルしたのが2016年12月22日ぐらい(テキサスに送られる
とあるHHMIの教授様がなかなか書いてくれなかった。他のものは30分で書いてくれるのに。。。ナオミの時と同じだったし。。。これが原因で遅くなった。もっとも引っ越しとか就活が入っていたのもあるけれども。。。



I-140が承認されたのが2017年6月19日ぐらい(約6ヶ月



推薦状は5 6通、すべて身内で固めた。。。Wendyにも書いてもらったの忘れていた。。。
HHMI, NAS, G&D editor とかいろいろ何気にある。リッチに頼もうかと思ったけど、小心者なので頼まなかった。日本人は大学院の時のSさんと学部の時のKさんにサインをお願いした。業績が業績なので、、、Nature Cell Scienceは審査官にも知られているらしいので,CNSを出して役に立ったというとこれぐらいになる。あとは政治的な利用はしていない(前のボスは政治的に最大限に利用していた)。というか使い方がわからないまま賞味期限が切れた。。。TETの仕事ももう4年前になる。。。



I-485, EAD, APをファイルしたのが2017年7月21日(テキサスに送られる

健康診断とワクチンを打ってもらう。
僕の病名は重症だけれども(みためはなんらかわらない)、それは問題なく、感染症が問題になるということらしい。


指紋は2017年8月14日(日程は2週間前に通知の手紙が届いた


ローカルオフィスへトランスファーしたという通知が9月の2週目に
???な状態だったけれども、地元で面接するからということで送られたのねってようやく理解できた。


地元での面接の日程(サンクス直後)決定の通知が10月の最後の週に送られてくる。


EADとAPが2017年11月4日に承認される(ファイルしてからだいたい100日前後
若干遅いんだけど。。。


ということで、今は届くのを待つところ。
そしてサンクス直後に面接がある。

あともう少し。
何かを待つというのは、何もしていないはずなのにすごく疲れる。

論文は書くために読む

のが、僕の座右の銘かもしれない。別に座右の銘ってないけれども。。。



論文に書いてあることの流れを追うとか、何が書いてあったか理解するって読み方だと、深く読めないし、自分のために勉強にならないと思うんだわな。そこにある意図を


ってか、natureクラスでも書くのに2週間ぐらいはかかるわけで、普通は2ヶ月ぐらい吟味しながらやっていたので、レビューをするのにも、1週間、2週間時間をかけるわけだし。僕はかなり早い時期から考えているので、4ヶ月、半年ぐらいは頭の中で色々作っていたわけだし。

それを1日、2日で読み込むのは無理だわな。







そういう意味では、最近論文を全く読んでいない。。。



へーって感じで読み流しているというのが正しいかもしれないけれども。





いい論文を読んでいれば、どういう風にロジックが組み立てられているかとか、すごく勉強になると思う。けれども、そういう読み方をしなければ、何も自分のものにならない。意図的に読むって、若い人が自然とできるものではないので、シニアな人がトレーニングに付き合う必要性があると思う。

ジャーナルクラブで1行1行やっていたら時間がなんぼあっても終わらない。



僕がいいイントロだと思うのは、イントロで書かれていることがディスカッションで締められていること。開きっぱなしのものは、どうよ?って感じになる。結構ありふれている。。。

wikiではないんだからな。。。って感じ。



とあるグループの論文はもう長年否定してきたので、ちょっと古い悪い例だけれども、
イントロダクションで、様々な動物種の遺伝子がクローニングされた。という事を書いたなら、それが論文の中でどういう意味を持つのか?ディスカッションで記載されていなければならない。そうする事で締まりが出てくる。

あたかも引用数を増やすためだけに引用されているように見え続けていた。。。
そこにだけ登場させるならいらないし、消した方がスッキリするのに。。。と思ったけれども色々な事情があったのだろう。



イントロダクションはテンプレートではないので、紋切りのようにあらゆる論文で"In vertebrates, ..."のコピペで始めるのは理解不能だった。


アイビーリーグのちょっと小賢しそうな学生が書きそうな、1700年代の論文を引っ張ってきて。。。というのも同じ事。知識をひけらかす場ではないので、、、と思ってしまう。イントロに記載した意味は何?ってことが書かれていないと、ただの知識になる。。。


イントロダクションで書いたことは必ずどこかでメンションするというのは大切なこと。だからイントロダクションに書くわけで、全ては繋がっているので、繋がっていない余計なことは書く必要性がない。


博士論文の序章がNIHのweb siteからの何十ページにも及ぶコピペとかいうのがあるような大学もあるらしいけれども。。。




長ければいいというのではない。出来るだけ短いほうがいいのと、接続詞を使わないでも、文と文の間が明らかなロジックを繋げること。Cellよりもnatureの方が好きです。1文あって、その根拠となるデータを参照。1分あって、その根拠となる論文を参照。全てに無駄がないものにならざるを得ない。
アクセプトになってからの、文字数を減らすというのは結構時間がかかる。。。


学部生や修士の時は、短いからということで、ジャーナルクラブとかで選んでいたけれども、実際に書くなると全く違う。特に、若い人たちには、時間を無駄にしないためにも、そういうトレーニングは大切だと思う。12月になって、学位論文、修士論文の原稿を書き始めて、添削されてからラストミニットで気がつくのではなく、普段からトレーニングできることだと思う。


いい上司に恵まれることが大切だと思う。






ちなみに、中国人でも、わからない単語があれば、そこに漢字で意味を書いたりしているのにはちょっと驚いた。え?そこの段階?って感じだったけれども。。。

Short double strand DNA

僕はこれまでに短いDNAを使って仕事をしてきた。

経験談としてで、原理的にどこまで正しいのかわからない部分がある。



基本的なノレッジとして、DNAが1-turnするには少なくとも10 bp程度が必要になる。
DNAの濃度(OD260)はATGCの含有量によって変わってくるので、
http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html
を使って計算している。

ある程度(30 bpほど)長ければTmも十分高いので、10 mM Tris-HCl, pH 8.0でアニーリングするのに十分ではあるものの、短くなれば、塩濃度を上げなければTmは4℃程度以下になる。
Tmが塩濃度依存性ということも知らなければ、塩なしではアニーリングをした後、室温の22℃でほとんどdouble strand DNAとして存在していないことがある。当然そのものをタンパク質と混ぜて結晶化させようとしても何も起こらない。

short DNAを用いて酵素活性を測定する時には特に注意が必要。
多くの酵素は0 mM NaClで活性がmaxになるものが数あるので、DNAの長さを短くするとassay条件で0 mM NaClにしてしまうとdsDNAが維持されているかどうかすらわからなくなるので、ある程度長いものを必然的に用意する必要がある。






僕は常に50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0を使っていた。
何も知らずに水にDNAを溶かして、annealingのステップを踏んでも出来上がったものは失敗作になる。
なかなか目に見える形にするのは難しいので、評価が難しい。


あと、根本的にDNAをMQで溶かすというのは関心しない。10 mMもしくは2 mM程度のTris-pH 8.0に溶かすのがいい。酸性に傾くと、バックボーンで切れやすくなる。
TE(10 mM Tris 8.0, 1 mM EDTA)でもいいけれども、EDTAは色々不必要なので、Trisのみで。

ヌクレースの活性にMgが必要なので、Mg++をキレートする意味でEDTAで活性を阻害できる。
Polymerase, Endo nucleaseにも活性にMg++が必要なので、そういう意味でEDTAを入れていない。
Ca++はこれらの阻害剤になる。



1 L程度のお湯を電子レンジで沸騰させて、DNAを等量加えたスクリューキャップのチューブに、フロートさせて6時間からオーバーナイト程度放置していた。温度を徐々に下げていくのがポイント。

PCRマシーンを使ってする方法があるらしいけれども、使ったことはない。
PCRマシーンを使えばもっと速く温度を下げることができるけれども、温度の下りがなだらかな、温浴を使っている。


薄い方がいいとされているけれども、結晶で使うには高濃度が必要であったりするので、10 mMのssDNA溶液を作って、equal volume加えて5 mMのdsDNAを作っていた。







どれぐらいの割合でdsDNAになるのか?ssDNAになるのか?
濃いものでもほぼ100%. (BioRadのdsDNAの濃度を測るおもちゃで計算した。)

200 μM程度のもので、蛍光標識をした10 bp程度のもので検討したことがあった。結論は、ほぼ100%に近いぐらいというのが結果で、あったとしても5%もないように見えた。ssDNAとdsDNAをnative pageで流して、移動度で調べた。蛍光で見ているので定量性はあるので少しはssDNAが残っているようにも見えたけれども、検出限界以下にしか存在しないように思われる。






repeated sequenceのものを使ったこともあった。
僕らが使っていたのは(CAG)12と(GTC)12のもの。
これも蛍光標識をして調べた。

理想とするものは
5'-CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG-3'
3'-GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC-5'
の36 bpのブラントエンドなのだけれども、

可能性としてオーバーハンギングで結合する可能性もあった。
これも電気泳動で調べると、1本のバンドしか見えなかった。
もちろん、ssDNAをコントロールとして流してあるので、dsDNAはssDNAと区別がつく。




可能性としては色々なフォームができ、ラダーが見えると思いきや、実は一番エネルギー的に安定なものしかできていなかった。こういうものは実際実験をやった結果があるから言えることで、あえて実験しないとわからない。これも完璧ではないけれども、複数のオリゴがさらに長いものを作るということはないようだ。

可能性としてannealing bufferの塩濃度を50 mMからさらにあげれば、温度の下げ方を変えれば、色々できていたかもしれないけれども、それは調べていないのでわからない。



特にssDNAの検出が難しい。
短いdsDNAでもEtBrに染めれば十分検出できる。ssDNAとdsDNAのEtBr染色による差は明らかでおよそ見た目で10〜20倍程度の違いがある。なので、何かで標識しなければ、定量的に話をすることは難しくなる。dsDNAであることを確認することはEtBrに染めればいいので簡単。特に4-nt, 6-ntのssDNAというのは染まらないので、あまりに短すぎるものでは評価が難しい。dsDNAのものに活性があるのか?ssDNAに活性があるのか?

ちなみにdsDNAとssDNAは泳動度に差があるので、すぐにわかる。




DNAのみであれば10 bp程度のdsDNAでもエタ沈も余裕でできる。回収率は95%程度で、もちろんグライコジェンを入れないと見えない。蛍光標識されていたので、UVに当てるとビカビカに光っていた


これが酵素反応後となれば、色々難しくなった。
まず、フエノクロが使えない。短いDNAは水層に行かないとされている。
余計なものが入っているとお手上げになっていた。

その時はもう少し長いもの、32 bpのものを使っていた。蛍光標識されているのでトレースが非常に簡単になる。わざわざ濃度を計らなくても、UVのところに持っていけば、光るので簡単にわかる。


TETの時は必ずProK処理しないと電気泳動をする時にスミアになった。
特製のformamide入りのdenature gelであったも。
色々試したけれども、ProKを入れる必要があることがわかった。


実はProK処理をしたものをG25に通して見ようとしたのだけれども、これもうまくいかなかった。
もちろんProKなしでもやったけれども、ダメだったし、reaction bufferにDNAを入れただけのものでもダメだった。Fe++がダメだったのか?って感じだったけれども。

これらは結局処理後、ProK処理をして、エタ沈をした。(2014a Natureで使った)


SAMを入れてメチル化した後もG25で精製できなかった。
これもProKも入れてみたけれども、ダメだった。
これはさらにエタ沈ができなかった。

ビオチン化して、、、ということも考えたけれども、結局は合成した方が安いということで合成したけれども、必要ならばバイチニレートしたものを合成して、SAマグネットで落とした方がいい。Kdが1 fMなのでそうそう問題が起こらない。この辺は綿密な計画を立てないと無駄が出てくる。


short oligoのTmが低いことを利用すれば、制限酵素で切断した後短いフラグメントが出現するようにすれば、片方にクエンチャー、片方にフルオロフォーをつけると、蛍光量を測定することでリアルタイムで活性を測定することもできる。50 mM NaClで6 bpのTmは16℃になるので、dsDNAが乖離して蛍光を発する。ポイントはクエンチャーをつけておくことで,乖離するとgain of signalにすることで、1%増えただけで十分検出できる。
下手にデザインすると1%減ることを検出しようとしてもなかなか難しい。
常に計算しておかないといけない。






僕はDNAとタンパク質の結晶の専門家なので、もう大量のプレートを見てきたのだけれども、DNAが結晶化しやすい条件がある。INDEXで言えばG11, G12, H1でほぼ間違いなくDNA。大半は細かいものだけれども、大きいものでもDNAと思われる。基本Diffしない。多くのDNAの結晶はP6になる。スクリューアクシスがdsDNAにある。

protein:DNAのモーラーレーショーは1:1.1~1.3程度にしているけれども、そこがクリティカルになったことはない。重要なのはDNAの長さ、配列になる。
5k5j, 5k5iにあるようにタンパク質に認識されていない塩基配列1つ変えるだけでspace groupが変わることもあったわけで、配列の方が重要になる。細かく比率を変えるというのはナンセンスになる。

たった一つのシトシンにメチル化を入れるだけでも結晶化の条件が全く異なることもあるので、必要ならばスクリーニングが必要になる。同じ条件で結晶化できることもあるけれども、出来ないこともあるわけで、「〜するはず」と言うのは間違い。


特異的な結合を見るのと、非特異的な結合を見ることができれば、なぜ、結合するのか?なぜ結合できないのか?ということを表と裏の両方から説明することができる。
一般論として、特異的な結合を見ている結晶は比較的容易だけれども、非特異な結合を結晶の中で見ることは非常に難しい。なので、どうしても片手落ちになってしまう。
やっている人は難しいとわかっているのでライティングは慎重に書いている。
データだけ見て、それは意味がないと言うのはナンセンスだと思う。

2014b G&Dは全セットのデータを取ることが出来たので、なかなかの論文になっている。
Lack of in vivo dataと書かれていたけれども。。。



僕は複合体にしか興味がないので、DNAの結晶が得られても、何も出来ない。
WT1をやっているときに、たまたまhigh resolutionでDNAの結晶のデータが取れて、MRで構造を決定したことがあったけれども、その構造が何を反映しているのか説明できないので、遊びでリファインメントをしたところで終わり。PDBにはデポしていない。構造を決定しても、それが正しいものを見ている証拠がなければダメだ。

この時はunit sizeが同じで違うDNA配列の構造がたまたまPDBにあったので、それを使ってMRすることで構造を決定した。つまりその構造は塩基配列特異的にその構造をとるということではない。


DNA/Protein complexにはPEG-ION I/IIが非常にいい。ほとんどは20% PEG3350なので、1:1と2:3でscreeningするといい。

結晶ができても、DNAのような結晶は無視している。
下手に、結晶ができたということで、big crystalsを作ろうとしても時間の無駄になる。
確率的にはゼロではないというだけ。
特にMg++, high (25%) PEGもしくは(35-60%) MPDの条件はそうだろう。
基本はP6

2012年夏当時作った結晶は、当初16 bpのものを使った。ターゲットとなるメチル化シトシンはasynmetricな位置に入れてあった。もう10年以上前にNEBが合成してくれたもので、MeCP2の結晶に使おうとしていたものである。これは3.74ÅまでしかDiffしなかったので、少しずつ短くして13 bpのものを使って2.89Åのデータセットを得た。非対称の位置にフルメチル化シトシンが入っているので、確率的には50%は結晶が出来ない。構造を決定後、方向がわかったので、ヘミメチル化シトシンを使って結晶を作ったのだけれども(タンパク質ーDNAが一義的に決まるように)、あまりいいことはなかった。

実際何が起こっているのかはわからない。

ちなみにDNAはタンパク質と複合体を作ることで形がディストーションするので、アイデアルなB-formを取っているわけではない。基本的にはDNAを用いてMRは出来ないとされている。微妙にピッチがずれているので難しいようだ。さらにオートメーションでモデルを作れないので、一つ一つビルトしていかないといけない。high resolutionのものでもAutobuildは使えない。2Aのデータならば、アミノ酸配列を入れるだけでほぼ正しくモデルを自動的にビルドすることができるけれども、1.5AでもDNAが入ってくると全く使い物にならない。人間の目でresolve mapを見れば、すぐにダブルストランドDNAのdensityとわかるものでも、コンピュータープログラムでは相当難しいようだ。







短いDNAを使ってbinding assayをするとき、気をつけなければならないことはノンスペシフィックな結合になる。

短いDNAだと、通常の細胞には存在しない末端がexposureされるので、そこに結合してしまう。2-bp認識するタンパク質でもそれだけではなく、通常、positively charged residues (Arg, His, Lys)とphosphate-protein interactionがあるので、そこで結合してしまう。なので、KD value of non-specific DNA binding がover-estimatedされてしまう。




基本的のassayにはFAMを使っていたのだけれども、Guanineの隣にするとクエンチングが起こる。
Blunt endにしておいた方がいい。さらにFAMを付ける方向を考えておいた方がいい。

短いものであればFAMをそのまま+200ドルほどで合成してもらえる。
長いものが必要なら通常通りPCRをして普通に増やして、通常のPCRのようにゲル回収、カラムで精製すればいい。

基本的には永久に使えるので半減期14日のP32で標識するよりも安価で、安全で、定量性があるので非常に便利。1回1回標識、精製する必要がないので、実験の再現性が高く、コスト削減で時間を生み出すことができる。検出にはタイフーンを使っているのだけれども、ブルーレーザーが必要。ブルーレーザーがないものも出回っているらしいので。

ブルーレーザーであれば10 fmolあれば十分なので、P32と変わらない。
しかも定量性があって、安全でスキャンは5分程度なので非常におすすめ。FITCのようにすぐにダメにならないので、室内灯の下では遮光する必要もない。
グリーンレーザーしかなければ20倍程度必要だけれども。。。

ちなみに、一度タイフーンで赤くなったものを定量しようとしておられる方がいた。。。
あれはサチっているので、定量するにはHiLoでサチっていないことを確認する必要が常にある。




色々思うに、前もって周到に準備する時間をケチるとダメだとわかる。




ちなみに市販のシリカのカラムを使って短いオリゴを生成できるのは〜17 bpまでで,PN bufferを使う必要がある.これはかなり回収率が良かったので悪い印象はない.

それ以下でもエタ沈で余裕で回収できるので基本は大丈夫ということになる.
現実的には6 bpのdsDNAとssDNAではそれがdsDNAであることが証明されていない限り実際何を見ているのかわからないことになる.

47 structures (5 days)

カバーレターに色々説得力があることを書いて,少しでも電話インタビューに繋がるようにしたい.


実際のシュミレーションと本番の英語電話インタビューとは別物なので,なるべく実戦を積んでいくしかないと思う.


しかも,当然ながら,英語なのであるわけで,高校の時でも5段階評価で3しかなかったり,毎週月曜日の英語のテストの時にほぼ毎回落第してきた自分にしては厳しいのは事実.
色々英語の番組を聞いていることで少しは英語に慣れようとしている(10年もUSに住んでいて今更だけど)


今,よく無謀なことをやっているよ...と思うけれども,そうするしかなかったから.毎日が失敗と後悔の連続.英語に限らず.

あの時,こうしておけばよかった.とかもうそんなんばっかり.
あの時こうしていたら,全く違っただろうとか.あるのは事実.




前回はもう崩壊的にグダグダになってしまったわけで,そのビッグミステイクの記憶が残っている間に次に生かしたい.先週アプライしたものは,コネのある企業(僕の論文を適当に見れば,あそこね.ってすぐにわかる...)も含めて早くても来週まで時間がかかるだろう.


現実は,今のところうまく行っていない.



外国人である故に特に英語に問題があるわけで,緊張している以前に,ちょっと小洒落た(僕にとって)単語を言われると,意味がわからないという致命的なものがある.

アカデミアではそういうことはある程度許容の範囲内かもしれないけれども,まずHRが入ってくるので,やはり大学内の中の英語程度では厳しい.HRでダメになる.ま,色々問題があるのだろうけれども,そこで止まる...


これまで応募してきたのは15個ぐらい.
やはりマッチから外れるかも?っていうものは一切応募してそれきり.


近郊から始めたのだけれども,これはどうなんだろう?って思う.
少し遠くから応募して場を踏んでから本命に!というのがいいのだろうか?と思っている.


カンパニーがあるのはやはりMA, CAになるので,今住んでいるところからではリロケーションが必要となり,治療中ということもあり,移植病院を移らなければならないということもあって,色々考えさせられる.病気でなければ,もう少し身軽だったのだけれども,どうしてもそうはいかない運命を背負っている.


幸い,心が解放されているので,血圧は薬を減らした状態でも安定している.


今回はウエンディーの働いているところなので,とりあえず内部情報を聞きながら...ということで.でもリファレンスは受け付けないって...ま,でもこういうのはとりあえずやってみるのは必要なので,そのうち.

とはいうものの,応募動機にちゃんと内部推薦の枠があった.
なので,ウエンディーのメアドを記載して,レジュメのリファフェンスにも.

ただ,人事が凍結しているらしく,昨日一昨日に出たものなのに?という疑問はあるけれども,内部推薦があるので,なるべく早く応募した.決まれば一緒に仕事に行くことができる!!



ちなみに前に電話があったところは,縁故があることが必要だとネットで書かれていたけど,サイエンティストに関しては関係がないようだった...歴史的な大失敗でダメだったけどね...



構造の仕事は,前から書いているように足を洗いたいと思っていて,ずっと蛋白質精製,生化学関係のものを応募してきたけれども,いくつかは構造の仕事も出してきた.

結局はカバーレター勝負と思っているので,やはりできるだけ具体的な数字を記載した方が説得力があるよね?ってことで,構造の仕事で,PDBにこれまでに47個登録した.こういう数字を出した方がやはり説得力があるということで,カバーレターに書いてみる.



賢い人は失敗を経ないまま,本番1回でできる人なんだろうって特に思う.
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